解放军海军总医院儿科栾佐教授谈神经干细胞移植治疗新生儿获得性脑损伤。
近年来新生儿缺氧缺血性脑病（包括早产儿脑损伤），新生儿脑梗死，新生儿胆红素脑病等新生儿获得性脑损伤所造成的神经系统后遗症的发病率并无显著降低。原因在于随着围产医学的发展，危重新生儿包括早产儿和低出生体重儿的存活率不断提高，而新生儿获得性脑损伤治疗却无突破性进展。近年国内外对亚低温治疗新生儿新生儿缺氧缺血性脑病方面研究较多，邵肖梅、Eicher等研究显示，选择性亚低温治疗对中度新生儿新生儿缺氧缺血性脑病有效，但对重度新生儿缺氧缺血性脑病患儿无效。因此，有必要寻找新的治疗新生儿获得性脑损伤的有效方法。
1．新生儿获得性脑损伤的共同病理基础是神经细胞丢失
新生儿获得性脑损伤发病原因、机制和临床表现虽然各不相同，但它们的病理基础是一样的，都经历了脑神经细胞凋亡与坏死、最终结果是脑功能神经细胞的丢失。足月儿脑神经元发育相对成熟，代谢旺盛，是缺血性损伤的主要靶细胞。新生儿缺氧缺血性脑病时主要表现为大脑旁矢状区、基底节、丘脑、皮质神经元为主的混合神经细胞凋亡、坏死、丢失以及伴发的胶质增生，过度髓鞘化和液化。与足月儿不同，早产儿脑少突胶质细胞发育不成熟，少突胶质前体细胞是缺氧缺血性损伤的高危期，此期晚期少突胶质细胞占少突胶质细胞细胞系的90%。新生鼠脑缺血损伤模型的研究证实缺血性损伤通过激活caspase23和诱导表达周期素激酶抑制物P27Kip1，使晚期少突胶质细胞大量调亡和离开细胞增殖周期，停止分裂并加速成熟分化，结果少突胶质细胞丢失、髓鞘形成受损。早产儿缺氧缺血性脑病表现为脑室周围白质软化。弥漫性脑室周围白质软化者神经轴突相对赦免，星形细胞反应性增生，表现为脑白质减少和脑室扩大；局灶性脑室周围白质软化型者缺血缺氧后，部分轴突破裂和大量的谷氨酸外渗，引起少突胶质细胞坏死，继而小胶质细胞侵润、肥大星形细胞和内皮细胞增生，大约5d后巨噬细胞出现， 2周后形成多发性小囊腔。局灶性脑室周围白质软化位于大脑皮层深部，以白质为主，影响到所有神经细胞组成，为混合神经细胞损伤。早产儿缺氧缺血性脑病还常出现脑室内出血，大量脑室内出血80%伴发脑室周围出血性梗死。由于脑室室管膜下为生发基质，此区域提供少突胶质细胞前体，因此， 脑室周围出血性梗死时表现为少突胶质细胞及星形胶质细胞混合性损伤。
2．神经干细胞移植治疗新生儿获得性脑损伤的实验研究
神经干细胞移植旨在替代损伤和丢失的神经细胞，重建受损的神经环路，支持和调动内源性神经细胞修复反应，极大地改变了传统治疗观念，为新生儿获得性脑损伤的治疗带来了新的希望。
2. 1新生动物神经干细胞移植效果优于成年动物研究资料表明神经干细胞移植的成功，与供体脑组织发育年龄、组织类型及解剖区域有一定关系；而宿主的年龄、接受移植时间、移植部位及损伤情况更为重要。Beutlage等比较年龄对神经干细胞移植的影响时，取孕14d鼠间脑制成单细胞组织悬液，分别植入生后3d、10d及20d的右侧黑质受损小鼠，6个月后观察其行为反应，3日、10日龄移植组苯丙胺诱发旋转反应明显，20日龄组和未移植对照组反应阴性。此研究结果表明受体年龄是神经干细胞移植获取成功的关键影响因素。
与成年动物神经干细胞移植相比，植入新生动物脑内的神经干细胞能广泛迁移，而成年动物脑内的神经干细胞往往仅达到移植部位附近的组织。Eriksson等将神经前体细胞分别植入新生鼠和成年鼠纹状体，发现新生鼠植入的神经前体细胞广泛迁移到整个纹状体而且沿内囊延伸至苍白球，而成年鼠植入细胞只停留在注射位置附近0.4～0.6mm的范围。除此之外，植入细胞的轴突投射范围也与年龄密切相关。Olsson将纹状体神经前体细胞植入新生小鼠纹状体，植入细胞广泛迁徙，其轴索沿内囊长距离投射，其投射能力随年龄增长而明显减弱，至成年鼠几乎丧失这些能力。作者认为中枢神经系统的轴突生长及再生过程是由生长促进/生长抑制因子两因素所调节，而新生动物及成年动物两者的表达水平是不相同的。在胚胎及出生后脑发育过程中，脑的内环境以神经营养因子的表达占主导地位，出生后，随着脑发育成熟，抑制因子逐渐占优势。新生动物的高再生潜能与其内环境生长抑制因子的低表达相关。
在移植条件相同的情况下受者年龄、脑发育成熟度、脑内微环境是神经干细胞移植成功的决定因素。神经干细胞移植时，植入细胞增殖、迁移、分化以及轴突的形成和髓鞘化，均是成年动物望尘莫及的。
2. 2神经干细胞移植对脑损伤新生动物模型的修复作用
针对脑白质损伤，Nave等将神经干细胞植入髓鞘发育缺陷的胚胎鼠脑，发现其能促进髓鞘再生和修复。Blakemore等将神经干细胞移植至脱髓鞘鼠脑内，亦发现神经干细胞能重建胶质细胞内环境，促进髓鞘修复、再生。Windrenm等从成人脑白质分选的A2B5 +少突胶质前体细胞植入小鼠胼胝体脱髓鞘模型损伤区，植入的前2周细胞分化成熟，A2B5 +少突胶质前体细胞在损伤中心区绝大部分分化为少突胶质细胞，在损伤周边区有少量分化为星形胶质细胞；植入3周后细胞在损伤区内广泛快速迁移，大量细胞开始表达MBP，形成MBP阳性的髓鞘片层和髓鞘化纤维。
缺血缺氧是新生儿最常见导致中枢神经系统后遗症的原因，近年来神经干细胞移植治疗缺血缺氧性脑损伤的实验研究屡见报道。Jansen等制成新生鼠缺血缺氧性模型后，将孕16d的胚胎鼠新皮层制成细胞悬液，植入损伤后3d的新生鼠感觉运动皮层区域，实验发现移植细胞呈现与正常脑皮层类似的神经化学表型，重建神经通路，并改善由于皮层损伤而引起的感觉运动功能障碍。另有实验，在新生小鼠缺血缺氧脑损伤后，从损伤同侧侧脑室移植C1712神经干细胞系，发现供体来源的细胞迁移并广泛整合到缺血区域，即使将神经干细胞移植到损伤对侧侧脑室，神经干细胞也向缺血损伤区域迁移，并在梗死区分化为神经元。我们知道，新生动物的缺血缺氧脑损伤主要与神经元的丢失有关，而神经干细胞能移行至损伤区域，分化为具有宿主区域特性的细胞，替代丢失的神经细胞，发挥正常生理功能。同时，新生鼠脑在受到损伤刺激时正常胚胎发育的重现亦是有利于神经干细胞移植的因素，而成年动物常常合并动脉粥样硬化供血不足，致移植效果不如新生动物。Mattson等比较成年鼠和新生鼠皮层梗死模型神经前体细胞移植效果，发现成年大鼠皮质仅偶见锥体细胞形成正常层次，而在新生鼠则形成典型涡状分层排列。进一步提示缺血性脑损伤新生小鼠进行神经干细胞移植效果更加突出。
笔者带领海军总医院儿科在这方面也做了一些工作。我们成功培养、扩增了人胎脑神经干细胞，并针对新生鼠和H IBD模型，经脑室移植神经干细胞。我们通过GFP转染， BrdU DNA掺入， PKH26膜标记等示踪植入细胞，发现植入细胞以1～2mm /d的速度3d内广泛迁移至同侧和对侧受损半球皮层、海马、小脑等损伤区；Nestin，NF， GalC、GFAP， Tuj1， Hb9 /ChAT细胞标志的多重免疫组化和接间免疫荧光分析技术证实，植入细胞大量增殖并分化为区域形态特异性的神经元、胶质细胞；海马源性神经干细胞的神经元分化比例高达80%以上，远远大于成年鼠神经元分化比例，损伤修复效果显著。
3．神经干细胞移植的临床应用研究
从20世纪80年代中期开始国外学者即将这一技术应用于临床。以后不断有人将来源于人胎儿中脑组织的多巴胺神经元移植至帕金森病患者脑中，部分患者在移植后1年，2～3年出现运动功能改善。在脑中风、脑梗死疾病的治疗中应用神经干/前体细胞亦取得了较好疗效。Kondziolka等将来源于人畸胎瘤细胞系NT22的神经前体细胞移植至12个中风患者的梗死灶，6个月时11个患者行FDP2PET检测，其中6个患者移植区代谢明显增强，欧洲卒中评分量表亦较术前明显提高，追踪观察12～18个月未发现移植相关血清学及影像学副反应，证明神经干细胞移植在脑梗死伴运动障碍患者的应用是可行的。Nelson等将人畸胎瘤细胞系NT22的神经前体细胞移植至一脑梗死患者病灶，27个月后患者病故时尸检，原位杂交分析表明植入部位的细胞多倍体与植入细胞一致，植入细胞未被排斥。胎脑来源的神经干细胞移植同样应用于亨廷顿病的治疗，其中1例患者18个月后患者死于心血管疾病，尸检及免疫组织学证实以上结果临床发现植入细胞存活、发育并表达典型的胆碱能神经元表型，替代损伤的宿主神经元，重建损伤的神经连接，同时移植部位未见免疫排斥细胞存在。国内也开展了相关临床研究，复旦大学华山医院进行了颅脑外伤自体神经前体细胞移植8例患者移植后2周至2年，功能核磁、FDG同位素扫描及运动功能有明显改善。
尽管神经干细胞/神经前体细胞移植应用于成人帕金森病、亨廷顿病、缺血性中风、老年性痴呆等已有较长时间，儿科尚无临床应用报道，至2005年10月美国FDA才首次公布批准斯坦福大学以异基因人胎脑神经干细胞脑内移植治疗6 例小儿Batten综合征(白痴性黑蒙) 。我科在长达5年的实验研究基础上，经过先后5次反复严格的论证， 2005年5月在国内外率先进行了第1例重度新生儿缺氧缺血性脑病后遗症患儿的人神经干细胞移植，术后患儿神经运动功能在短时间内明显改善， FDG2PET显示原低代谢区代谢明显增强，MR I显示脑容积增加。在随后进行的重度新生儿缺氧缺血性脑病、早产儿脑损伤、新生儿脑梗死，新生儿胆红素脑病后遗症患儿的移植治疗中，多数患儿显示了运动功能改善及fMR I、VEP及脑电图的不同程度的好转。最近，我科有机会对1例新生儿获得性脑损伤患儿于急性期进行神经干细胞移植。患儿马××，女， 6 日龄，病历号300233，因“煤气中毒2d伴频繁惊厥”入院。入院后昏迷、惊厥，德巴金、咪唑安定持续静点6d才缓解。发病第9天（生后15d）NBNA评分12分，MR I检查显示：全脑弥漫性水肿明显，灰质、白质区及脑干可见广泛长T1、T2信号，发病第10天(生后16d)行神经前体细胞移植，移植后12d(生后28d)NBNA 30分，移植后28d (生后44d)MR I复查，灰白质信号对比与月龄大致相符，各部脑组织内未见明确病理信号。移植后78d复查(生后92d)查追视180°，对声音敏感，逗引笑出声，发“啊、哦、伊、呀”音，吃手，拉起跟头，直立位竖头，俯卧位肘支撑，抬头90°，有侧翻动作，双下肢短暂支持，四肢肌张力正常，未见异常姿势与反射，儿心评估发育商109分， Peabody粗大运动104分，精细运动99，两种量表评估患儿发育水平均在正常范围，达中等智能和运动发育水平。本例提示新生儿获得性脑损伤宜尽早进行神经干细胞移植，动物实验亦表明发病1～2周以内进行神经干细胞移植最佳，急性期进行神经干细胞移植疗效更加显著，而且，有可能最大程度地减轻或预防神经系统后遗症的出现。应当指出的是，我们目前进行的人神经干细胞移植例数尚少、最长观察时间才1年，远期疗效有待进一步观察。从移植的短期疗效看，人神经干细胞移植治疗新生儿获得性脑损伤是有效的。如果重度新生儿缺氧缺血性脑病、早产儿脑损伤、新生儿脑梗死、新生儿胆红素脑病等新生儿获得性脑损伤患儿能在急性期施以神经干细胞移植，同时辅以早期干预治疗及康复训练，势必进一步提高疗效，最大程度地减少和防止后遗症的发生。
近年有关新生动物神经干细胞移植的研究为治疗新生儿获得性脑损伤带来了新的希望。利用内、外源性神经干细胞的互动效应，神经干细胞移植可能作为挽救性治疗手段，最大限度地调动自身修复反应，修复与防治脑损伤；利用神经干细胞多潜能分化的特点，神经干细胞移植可能成为一有效的治疗方法，替补丢失的神经细胞，修补已造成的脑损伤；利用胎儿发育特点，采取宫内移植，神经干细胞移植可能作为有效的宫内干预措施，防治宫内窘迫和脑发育迟缓。但与造血干细胞移植相比(笔者长期从事小儿造血干细胞移植) ，神经干细胞移植还处于起步阶段，还有许多基础与临床问题有待进一步研究，实现高效、特异、可行的神经干细胞移植还有漫长的路要走，切不可一哄而上，尤其要警惕为效益和时尚所动，在一无细胞学研究基础与条件，二无长期相关动物实验的前提下的冒进行为。我们有理由相信，只要我们坚持不懈、埋头苦干，随着神经干细胞及其移植技术的不断提高和医学的进步，有效防治新生儿获得性脑损伤将不再遥远，这一天必将来到。