胚胎干细胞的培养与分化

人胚胎干细胞是从早期的胚胎内细胞团分离培养成的多能干细胞，其在体外培养过程中可以维持干细胞的未分化状态、正常的二倍体核型及无限的增殖能力，具有体内外分化能力和种系的嵌合能力，并可在体外进行各种基因操作。
人胚胎干细胞研究的科学价值在于能够自我更新并具有分化多潜能性，使人们不仅可以获得需要的细胞，也有希望获得某个器官，甚至用基因改造的人胚胎干细胞培育出没有排斥反应的细胞、组织、器官，具有广阔的临床应用前景。另外，人胚胎干细胞也可为研究药物对胚胎组织的毒性和发育生物学提供了一个很好的体外实验模型。
人类胚胎干细胞的基本特征，除来源于囊胚内细胞团或原始生殖细胞外，尚具有无限的增殖能力；正常、完整、稳定的染色体核型；向胚胎的3个胚层来源的所有细胞分化的能力；和必须能够表达特异的表面标志，如AKP，SSEA，TRA等。
人胚胎干细胞对培养条件的要求十分苛刻。本期专题介绍的10篇文章，分别从胚胎干细胞培养及生长与分化等方面作了有益的探索，更多内容详见本期3482页。

1  人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性比较

胡智兴
昆明医学院药理学教研室，云南省昆明市  650031
云南省自然科学基金项目(2005C0013R)；云南省应用基础研究项目(2007C0044R)

人源饲养层上的人胚胎干细胞形态

鼠源饲养层上的人胚胎干细胞形态

推荐理由：目前，采用各种人源细胞饲养层来维持人胚胎干细胞的生长已获得成功，其中包括永生化人成纤维细胞。但对各种来源的饲养层支持人胚胎干细胞生长的比较研究很少，不同来源饲养层下人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚。
实验分别利用永生化人成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养人胚胎干细胞株BG02，对比其生长特性以及全能性标记表达的差异，结果发现在这两种饲养层上的人胚胎干细胞形态相似，均表达人胚胎干细胞的特异性标志物；但在永生化人成纤维细胞饲养层的人胚胎干细胞Oct-4+率更高，细胞倍增时间更长。实验结果为下一步建立高效、安全、标准化“临床级”的人胚胎干细胞培养体系奠定了基础。见2009年49期9757页。

2  人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

胡智兴
昆明医学院药理学教研室，云南省昆明市  650031
云南省科技厅-昆明医学院应用基础研究联合专项基金(2007C0012R；2007C0044R)

推荐理由：以往人胚胎干细胞的无血清无饲养层培养体系多采用胞外基质和添加碱性成纤维细胞生长因子等方法。实验通过添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS，建立了人胚胎干细胞新的无血清无饲养层培养体系，并维持人胚胎干细胞自我更新，该无血清无饲养层培养体系未见报道。
实验证实了以往研究报道关于胰岛素样生长因子信号和碱性成纤维细胞生长因子信号的协同作用，能够维持人胚胎干细胞自我更新的假设，并将其进一步成功运用于人胚胎干细胞的培养。见2009年45期8889页。

3  利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系

谭季春
中国医科大学医学遗传学教研室，辽宁省沈阳市  110003
辽宁省自然科学基金(20042117)；沈阳市科委重点项目(1032043-3-05)

培养5 d的人胚胎干细胞克隆

推荐理由：囊胚由内细胞团及滋养外胚层两类细胞组成。内细胞团可分化成胚胎全部组织及胚外结构，滋养外胚层则生长成为胎盘。人胚胎干细胞由种植前囊胚胚胎内细胞团中获得。目前认为，为提高建系效率，必须具备高质量囊胚和改善培养系统。
实验利用剩余的人冷冻胚胎建立人胚胎干细胞系，利用流产胎儿分离的原始生殖细胞建立人胚胎干细胞系，在体外培养4个月；初步诱导神经细胞和心肌细胞；将流产胎儿皮肤成纤维细胞和人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养人胚胎干细胞培养成功；比较了两种不同来源人胚胎干细胞的增殖特点。见2009年23期4517页。

4  成纤维细胞生长因子支持人胚胎干细胞在无饲养层中的生长

许慧芳
华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北省武汉市  430030
国家自然科学基金资助项目(30600188)

推荐理由：人胚胎干细胞是一种全能型细胞，可以分化为3个胚层的组织，目前国内对其无饲养层生长的研究较少。成纤维细胞生长因子是维持胚胎干细胞不分化状态的重要因子。
实验通过观察长期培养过程中不同质量浓度成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞未分化状态和全能性维持的影响。结果显示成纤维细胞生长因子质量浓度达160 μg/L以上时，可以单独支持人胚胎干细胞的体外稳定增殖，且不影响细胞分化状态和全能性。见2010年6期1111页。

5  四种胞外基质支持人胚胎干细胞的生长：效果有差异吗？

胡智兴
昆明医学院药理学教研室，云南省昆明市  650031
云南省科技厅-昆明医学院应用基础研究联合专项基金资助项目(2007C0012R，2007C0044R)；云南省自然科学基金(2005C0013R)

推荐理由：现已明确胞外基质在维持人胚胎干细胞的自我更新和未分化状态方面具有重要作用，其中Matrigel、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、胶原等已运用于人胚胎干细胞的无饲养层无血清培养。但是生长在不同培养基质上的人胚胎干细胞是否具有相同的生物学特性，以及对于特定的人胚胎干细胞株，何种胞外基质最适宜等问题均有待于研究对比和筛选。
实验通过对比人胚胎干细胞系BG02在预铺有纤粘连蛋白、Ⅳ型胶原、Matrigel、层粘连蛋白4种胞外基质的生长特点，旨在建立人胚胎干细胞的无饲养层无血清培养体系，为深入研究胞外基质对维持人胚胎干细胞自我更新和未分化状态的作用以及相关信号分子机制提供实验基础。见2010年6期1027页。

6  两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征

冯建勋
新疆医科大学第一附属医院博士后科研流动站，乌鲁木齐市友谊医院肾内科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市  830049
博士后科学基金资助项目(第四十三批，20080431282)

推荐理由：目前对干细胞的体外分离纯化技术大多是建立在对细胞表面标记识别的基础之上，具体方法有单抗贴壁铺展法、流式细胞分选法、免疫磁珠分选法等，但上述方法操作复杂，价格昂贵。有学者在直接贴壁分离法的基础上，根据细胞形态，采用机械方法分离培养羊水干细胞，但实际操作后仍感复杂且易污染。
因此本实验对两期培养方法加以改进和简化，用一种新的两步培养法分离培养羊水MSCs，而且不干扰常规的产前诊断程序。结果证实采用两步培养法可以在不影响正常产前诊断的前提下获得大量胎儿来源间充质干细胞。见2009年45期8854页。

7  体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞最佳胚龄的筛选：孕2.5 d与3.5 d及4.5 d比较

张海锋
徐州医学院解剖教研室，江苏省徐州市  221004
辽宁省自然科学基金(20032142)；徐州医学院课题基金(08KJ19)

孕4.5 d胚胎多为囊胚，囊腔明显，可见滋养层，有些形成内细胞团

推荐理由：课题主要内容为从受孕小鼠体内获得发育至桑椹胚或胚泡阶段的早期胚胎，用机械法分离、胰酶消化内细胞团得到原始的胚胎干细胞悬液；将得到的胚胎干细胞置于MEF饲养层上或单用条件培养基(含白血病抑制因子)分别进行培养，比较体外培养的效果；最后对得到的胚胎干细胞产用形态学观察、表面标记检测、体内外分化实验来进行检测鉴定；将成功培养得到的胚胎干细胞定向分化为神经细胞，以移植治疗脊髓损伤动物，为胚胎干细胞的临床应用提供一些实验依据。见2010年10期1780页。

8  序贯法诱导小鼠胚胎干细胞向神经元样细胞的分化

李晓丰
中国医科大学基础医学院发育生物学教研室，辽宁省沈阳市  110001
辽宁省自然科学基金研究项目(20062090)；辽宁省教育厅科学技术研究项目(2004D227)

诱导第4天细胞显微镜下形态

推荐理由：目前，胚胎干细胞在体外定向诱导分化为神经细胞的文献报导诸多，国内外诱导方法大致可以分为两大类：基因修饰和基因外诱导。基因修饰，是将一个神经特异性基因转染入胚胎干细胞，再通过筛选报告基因或标志基因而得到神经细胞。基因外诱导，是在基因外即细胞水平对胚胎干细胞进行诱导使其分化，包括使用特异性诱导剂、基质细胞共培养法和序贯诱导法等。
目前国内外有很多实验室都在研究胚胎干细胞的培养、建系和定向诱导分化的问题，实验应用建系的胚胎干细胞，通过“序贯诱导法”，即逐步降低培养液的血清浓度和添加细胞生长因子，进行神经方向的定向诱导，并对诱导后细胞进行免疫荧光染色和流式细胞仪检测，首次得出了诱导分化比率，实验周期短，实验方法简便，诱导效果稳定、高效，具有一定的创新性。见2009年32期6236页。

9  小鼠胚胎肝干细胞体外向肝样细胞的诱导分化

赵文秀
厦门大学附属中山医院肝胆外科，福建省厦门市  361004
国家自然科学基金资助项目(30872484)；福建省自然科学基金资助项目(C0610044)

推荐理由：近年来对于肝脏是否存在肝干细胞，很多学者进行了大量的研究。实验已证实肝干细胞的存在及可能的组成，并对其生物学特性也有所了解。肝干细胞的基本特征主要有两点：双向分化能力，可向肝细胞和胆管细胞分化；自我更新能力。目前，虽然在肝干细胞分离纯化鉴定、体外扩增培养、定向诱导分化等方面取得了一些进展，但仍存在很多问题。
实验通过体外分离、培养及纯化肝干细胞，并将其诱导分化为成熟的肝细胞，为临床各种肝病的细胞治疗提供可靠的细胞来源，并证实其在丁酸钠盐及二甲基亚砜作用下可以向肝细胞分化，同时也为研究肝干细胞定向分化中涉及的信号转导通路提供了一个较好的实验模型。见2009年36期7103页。

10  体外局部微环境下小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化

杨建华
佳木斯大学附属第一医院骨外一科，黑龙江省佳木斯市 154002
黑龙江省自然基金(D2007-91)；黑龙江省卫生厅基金(2006-352)；黑龙江省教育基金(11511402)

推荐理由：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离出来的高度未分化全能细胞，具有发育成各种类型细胞的潜能，在体外培养系统中可扩增并维持其全能性。在一定条件下，胚胎干细胞可诱导分化成为神经前体细胞，当移植到健全或损伤的中枢神经系统后，可与宿主细胞有效整合，修复重建损伤的神经组织。
胚胎干细胞诱导产生神经细胞的方法通常必须经过两个步骤：首先是生物物理状态下胚胎干细胞的聚集(拟胚体)，再经过生物化学信号全反式维甲酸的诱导。实验初步探讨了胚胎干细胞向神经前体诱导过程和影响因素，为进一步探讨胚胎干细胞分化调控机制、体内移植、分化能力以及神经元缺失的替代修复作用奠定了实验基础。见2009年1期75页。